Proizvodi

Da bismo specifično kvantificirali nekoliko metabolita 5-fluorouracila (5-FU) i dva endogena monofosfatna nukleotida, razvili smo originalnu metodu zasnovanu na tečnoj hromatografiji-tandem masenoj spektrometriji (LC-MS/MS).Ovaj test je omogućio određivanje: (i) unutarćelijske proizvodnje 5-fluoro-2′-deoksiuridin-5′-monofosfata (5-FdUMP) iz 5-FU ili 5-fluoro-2′-deoksiuridina (5-FdUrd) , (ii) utjecaj koncentracije 5-FdUMP na omjer intracelularnog 2′-deoksiuridin-5′-monofosfata (dUMP)/timidin-5′-monofosfata (TMP), i (iii) opseg sekrecije 5-FdUMP i 5-FU iz humanih ćelija kultiviranih ABC transporterima.U našim eksperimentalnim uslovima, ćelije su inkubirane sa 5-FU ili 5-FUrd.Zatim su ćelijski proteini precipitirani metanolom.Ovaj postupak je omogućio visok oporavak ekstrakcije.Osim toga, da bismo izmjerili sekreciju 5-FU i 5-FdUMP iz ćelija, izvršili smo kvantifikaciju ovih molekula u mediju kulture.Mediji su ili direktno ubrizgani (5-FU) ili podvrgnuti ekstrakciji čvrste faze pomoću Oasis Wax ekstrakcionog uloška (5-FdUMP).Odvajanje analita izvršeno je na dC18 Atlantis 3,5 μm, (100 mm × 2,1 mm id) koloni sa izokratskim načinom korištenja amonijum formatnog pufera/metanola/vode (5/5/90, v/v) kao mobilne faze.Vrijeme rada nije prelazilo 6,2 min.Analiti su jonizovani u elektrosprej interfejsu u režimu negativnih jona.Mi smo validirali metodu u rasponu od 2,5-150 ng mL -1 prema jedinjenjima.Intra- i inter-test varijabilnost je bila niža od 10% tokom sedam dana.Sva jedinjenja su bila stabilna u ćelijama ili u medijumu kulture kada su uzorci čuvani na -20 °C najmanje dve nedelje i nakon tri ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja.Nije uočen matrix efekat u oba medija.