Proizvodi

Fosforilacija proteina regulira različite ćelijske funkcije i igra ključnu ulogu u ranom razvoju biljaka.Kako bismo nadopunili i proširili prethodna istraživanja fosforilacije proteina u sadnicama Arabidopsis, koristili smo alternativni pristup koji kombinuje ekstrakciju proteina u nedenaturirajućim uvjetima s imobiliziranim metal-ionskim afinitetnom hromatografijom (IMAC) obogaćivanjem intaktnih fosfoproteina u ekstraktima osiromašenim Rubisco, nakon čega slijedi identifikacija korištenjem dvodimenzionalne gel elektroforeze (2-DE) i tečne hromatografije-tandem masene spektrometrije (LC-MS/MS).Razlaganje tripsina u gelu i analiza odabranih gel tačaka identificirali su 144 fosforilirana peptida i ostataka, od kojih je samo 18 fosfopeptida i 8 fosfozita pronađeno u bazama podataka fosforilacijskih mjesta PhosPhAt 4.0 i P3DB Arabidopsis thaliana.Više od polovine od 82 identificirana fosfoproteina bilo je uključeno u metabolizam ugljikohidrata, fotosintezu/disanje ili mehanizme odgovora na oksidativni stres.Čini se da obogaćivanje intaktnih fosfoproteina prije 2-DE i LC-MS/MS poboljšava detekciju fosforiliranih ostataka treonina i tirozina u poređenju sa metodama koje koriste obogaćivanje na nivou peptida, što sugerira da su dva pristupa donekle komplementarna u smislu pokrivenosti mjesta fosforilacije.Upoređujući rezultate za mlade sadnice sa onima koji su prethodno dobiveni za zrelo lišće Arabidopsis identificirano je pet proteina koji su različito fosforilirani u ovim tkivima, pokazujući potencijal ove tehnike za istraživanje dinamike fosforilacije proteina tokom razvoja biljaka.