IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozid) je analog supstrata β-galaktozidaze, koji je vrlo inducibilan.Pod indukcijom IPTG-a, induktor može formirati kompleks sa represorskim proteinom, tako da se konformacija represorskog proteina menja, tako da se ne može kombinovati sa ciljnim genom, a ciljni gen se efikasno eksprimira.Kako onda treba odrediti koncentraciju IPTG-a tokom eksperimenta?Je li što veće to bolje?
Prvo, shvatimo princip indukcije IPTG: laktozni operon (element) E. coli sadrži tri strukturna gena, Z,Y i A, koji kodiraju β-galaktozidazu, permeazu i acetiltransferazu.lacZ hidrolizira laktozu u glukozu i galaktozu, ili u alo-laktozu;lacY dozvoljava laktozi iz okoline da prođe kroz ćelijsku membranu i uđe u ćeliju;lacA prenosi acetilnu grupu sa acetil-CoA na β-galaktozid, što uključuje uklanjanje toksičnog efekta.Pored toga, postoji operativna sekvenca O, početna sekvenca P i regulatorni gen I. I genski kod je represorski protein koji se može vezati za poziciju O operatorske sekvence, tako da je operon (meta) potisnut i ugašeno.Takođe postoji mesto vezivanja za protein kataboličkog gena aktivatora-CAP vezujuće mesto uzvodno od inicijalne sekvence P. P sekvenca, O sekvenca i mesto vezivanja CAP zajedno čine regulatorni region lac operona.Kodirajući geni tri enzima su regulisani istim regulatornim regionom kako bi se postigla koordinirana ekspresija genskih proizvoda.
U nedostatku laktoze, lac operon (meta) je u stanju potiskivanja.U ovom trenutku, lac represor eksprimiran I sekvencom pod kontrolom sekvence promotora PI se vezuje za O sekvencu, što sprečava da se RNA polimeraza veže za P sekvencu i inhibira inicijaciju transkripcije;kada je laktoza prisutna, lac operon (meta) se može inducirati. U ovom operonskom (meta) sistemu, pravi induktor nije sama laktoza.Laktoza ulazi u ćeliju i katalizuje je β-galaktozidaza da bi se pretvorila u alolaktozu.Potonji se, kao induktorski molekul, vezuje za protein represor i mijenja konformaciju proteina, što dovodi do disocijacije proteina represora od O sekvence i transkripcije.Izopropiltiogalaktozid (IPTG) ima isti učinak kao alolaktoza.Veoma je moćan induktor, koji se ne metaboliše bakterijama i veoma je stabilan, pa se široko koristi u laboratorijama.
Kako odrediti optimalnu koncentraciju IPTG-a?Uzmimo E. coli kao primjer.
Genetski modifikovan soj E. coli BL21 koji sadrži pozitivni rekombinantni pGEX (CGRP/msCT) inokuliran je u LB tečnu podlogu koja sadrži 50 μg·mL-1 Amp, i kultivisan preko noći na 37°C.Gornja kultura je inokulisana u 10 boca sa 50 mL svežeg LB tečnog medijuma koji sadrži 50 μg·mL-1 Amp u odnosu 1:100 za ekspanzionu kulturu, a kada je vrednost OD600 bila 0,6~0,8, IPTG je dodan konačnoj koncentraciji.To je 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1.Nakon indukcije na istoj temperaturi i u isto vrijeme, iz njega je uzeto 1 mL bakterijske otopine, a bakterijske ćelije su sakupljene centrifugiranjem i podvrgnute SDS-PAGE za analizu utjecaja različitih koncentracija IPTG na ekspresiju proteina, a zatim odaberite IPTG koncentraciju s najvećom ekspresijom proteina.
Nakon eksperimenata, ustanovit će se da koncentracija IPTG-a nije što je moguće veća.To je zato što IPTG ima određenu toksičnost za bakterije.Prekoračenje koncentracije će također ubiti ćeliju;i generalno govoreći, nadamo se da je to bolje što je topljiviji protein izražen u ćeliji, ali u mnogim slučajevima kada je koncentracija IPTG-a previsoka, formiraće se velika količina inkluzije.Tijelo, ali se smanjila količina topivih proteina.Stoga, najprikladnija koncentracija IPTG često nije veća to bolja, već niža koncentracija.
Svrha indukcije i uzgoja genetski modificiranih sojeva je povećanje prinosa ciljnog proteina i smanjenje troškova.Na ekspresiju ciljnog gena ne utiču samo sopstveni faktori soja i ekspresioni plazmid, već i drugi spoljni uslovi, kao što su koncentracija induktora, temperatura indukcije i vreme indukcije.Stoga je općenito, prije nego što se nepoznati protein ekspresira i pročisti, najbolje je proučiti vrijeme indukcije, temperaturu i koncentraciju IPTG-a kako bi se odabrali odgovarajući uvjeti i dobili najbolji eksperimentalni rezultati.
Vrijeme objave: 31.12.2021