Proizvodi

Novi test tečne hromatografije visokih performansi za glikoziltransferaze zasnovan na derivatizaciji antranilnom kiselinom i detekciji fluorescencije.

Testovi su razvijeni korišćenjem jedinstvene hemije obeležavanja 2-aminobenzojeve kiseline (2AA; antranilna kiselina, AA) za merenje aktivnosti i β1-4 galaktoziltransferaze (GalT-1) i α2-6 sijaliltransferaze (ST-6) tečnosti visokih performansi hromatografija (HPLC) sa detekcijom fluorescencije (Anumula KR. 2006. Napredak u metodama fluorescentne derivatizacije za tečnu hromatografsku analizu glikoproteinskih ugljenih hidrata visokih performansi. Anal Biochem. 350:1-23).N-acetilglukozamin (GlcNAc) i N-acetillaktozamin su korišćeni kao akceptori, a uridin difosfat (UDP)-galaktoza i citidin monofosfat (CMP)-N-acetilneuraminska kiselina (NANA) kao donori za GalT-1 i ST-6, respektivno.Enzimski proizvodi su označeni in situ sa AA i odvojeni od supstrata na TSKgel Amid 80 koloni koristeći uslove normalne faze.Enzimske jedinice određivane su iz područja pikova poređenjem sa istovremeno derivatizovanim standardima Gal-β1-4GlcNAc i NANA-α2-6 Gal-β1-4GlcNAc.Utvrđena je linearnost (vrijeme i koncentracija enzima), preciznost (intra- i međutest) i reproduktivnost za testove.Utvrđeno je da su testovi korisni u praćenju aktivnosti enzima tokom izolacije i prečišćavanja.Testovi su bili vrlo osjetljivi i izvedeni su jednaki ili bolji od tradicionalnih mjerenja na bazi radioaktivnog šećera.Format analize se takođe može koristiti za merenje aktivnosti drugih transferaza, pod uslovom da akceptori ugljenih hidrata sadrže redukcioni kraj za obeležavanje.Razvijen je test za akceptore glikoproteina korištenjem IgG.Razvijena je kratka metoda HPLC profilisanja za odvajanje IgG glikana (bitenarnih G0, G1, G2, mono- i disijaliranih), što je omogućilo brzo određivanje aktivnosti GalT-1 i ST-6.Nadalje, ova metoda profiliranja bi se trebala pokazati korisnim za praćenje promjena u IgG glikanima u kliničkim uvjetima.