Proizvodi

Način na koji se efekti simultanih mutacija kombinuju za promjenu enzimske aktivnosti nije lako predvidjeti jer ti efekti nisu uvijek aditivni na linearan način.Dakle, karakterizacija efekata istovremenih mutacija aminokiselinskih ostataka koji vezuju supstrat može dati značajan doprinos razumevanju specifičnosti supstrata enzima.U beta-glikozidazi iz Spodoptera frugiperda (Sfbetagly), oba ostatka Q39 i E451 stupaju u interakciju sa supstratom i to je bitno za definiranje specifičnosti supstrata.Dvostruki mutanti Sfbetagly (A451E39, S451E39 i S451N39) pripremljeni su mutagenezom usmjerenom na mjesto, eksprimirani u bakterijama i pročišćeni afinitetnom hromatografijom.Ovi enzimi su karakterizirani korištenjem p-nitrofenil beta-galaktozida i p-nitrofenil beta-fukozida kao supstrata.Odnos k cat/Km za pojedinačne i dvostruke mutante Sfbetagly koji sadrže mutacije usmjerene na mjesto na pozicijama Q39 i E451 korišten je da se pokaže da je učinak dvostrukih mutacija (Gdouble) na slobodnu energiju ESdouble bodeža (kompleksa enzimskog prijelaznog stanja) daggerxy) nije zbir efekata koji su rezultat pojedinačnih mutacija (Gdouble daggerx i Gdouble daggery).Ova razlika u Gdouble bodežu ukazuje na to da se efekti pojedinačnih mutacija djelomično preklapaju.Dakle, ovaj uobičajeni efekat se računa samo jednom u Gdouble daggerxy.Kristalografski podaci o beta-glikozidazama otkrivaju prisustvo bidentatne vodonične veze koja uključuje ostatke Q39 i E451 i istu hidroksilnu grupu supstrata.Prema tome, i termodinamički i kristalografski podaci ukazuju na to da ostaci Q39 i E451 međusobno utiču na interakciju sa supstratom.